時(shí)間分辨微球（羧基）偶聯(lián)方法

粒徑： 100nm-300nm

激發(fā)/發(fā)射：365/610nm

Ⅰ.  微球的清洗

一般取 1mg 微球(10mg/ml) 標(biāo)記 0.1mg 抗體，不同項(xiàng)目可進(jìn)行兩邊濃度摸索優(yōu)化。

具體操作流程如下：

1.100ul 微球 + 900 ul 標(biāo)記緩沖液（50mM MES,pH 6.0，或者0.05MPBS,pH 6.0）；

2.17000rpm,離心 20min，第一遍；

3.去掉上清，用 1000ul 標(biāo)記緩沖液重懸微球；

4.17000rpm,離心 20min，第二遍；

5.去掉上清，用 1000ul 標(biāo)記緩沖液重懸微球（離心后微球重懸可使用水浴超聲儀，建議功率 500-700W，超聲時(shí)長(zhǎng) 2-5min，下同），備用。

Ⅱ.  微球的活化

各稱取 20mg NHS 和 EDC，用標(biāo)記緩沖液溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，即 20mg/ml NHS 和 EDC； 取 20ul NHS，加入到清洗后的微球中，快速混勻；

然后再取 5ul EDC 加入到微球中，快速混勻； 室溫孵育，20-30min。

Ⅲ.  清洗去除殘留 EDC將活化后的微球：

1.17000rpm,離心 20min，第一遍；

2.去掉上清，用 1000ul 標(biāo)記緩沖液重懸微球；

3.17000rpm,離心 20min，第二遍；

4.去掉上清，用 1000ul 標(biāo)記緩沖液重懸微球，備用。

IV.  微球與抗體的偶聯(lián)

取 0.1mg 抗體溶解于（50mM MES,pH 8.5，或者0.05MPBS,pH 8.5）于 2ml 離心管中，加入活化后的微球，快速混勻后，室溫孵育，3 小時(shí)。

Ⅴ.  封閉

配制 20mg/ml 的 BSA，即稱取 20mg BSA,用終濃度 100mM 乙醇胺溶液充分溶解，備用。

微球標(biāo)記抗體后，加入 100ul 上述封閉液（含 BSA），室溫孵育 1 小時(shí)。 Ⅵ.  去除未結(jié)合的抗體

此步驟目的是通過高速離心的方法去除游離的未結(jié)合微球的抗體；

具體流程如下：

1.17000rpm,離心 20min，第一遍；

2.去掉上清，用 1000ul 稀釋液（50mM PBS，pH 7.4 或 50mM Tris，pH 8.0）重懸微球；

3.17000rpm,離心 20min，第二遍；

4.去掉上清，用 1000ul 稀釋液重懸微球，即為抗體-微球標(biāo)記復(fù)合物，4℃放置備用， 如長(zhǎng)期保存需加入終濃度為 0.2% BSA 和 0.02% NaN3 溶液。

注意事項(xiàng)

1. 保存條件：本產(chǎn)品需要于 2-8℃保存，切勿冷凍；

2. 本產(chǎn)品在使用前確認(rèn)處于均勻的懸浮狀態(tài)，有輕微結(jié)塊可以用超聲去除；

3. 本產(chǎn)品活化后建議立即進(jìn)行偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)，活化狀態(tài)不宜長(zhǎng)時(shí)間保存；

4. 本產(chǎn)品僅供科研使用。